La enfermedad de Hansen presenta un amplio espectro de manifestaciones clínicas e histopatológicas, las cuales son un reflejo de la naturaleza de la respuesta inmunológica del individuo ante diversos componentes del Mycobacterium leprae. La interacción entre el sistema inmune del huésped y diferentes componentes micobacterianos nos permite conocer aspectos de la respuesta inmunológica diferencial tanto serológica como respuesta celular en los pacientes con enfermedad de Hansen. En este trabajo se trata de resumir los avances en las últimas 4 décadas realizados en la enfermedad de Hansen sobre las pruebas inmunológicas diagnósticas (hipersensibilidad retardada HR, proliferación celular in vitro y pruebas de anticuerpos) aplicadas tanto en el Instituto de Biomedicina como ensayos actualizados realizados en otras diferentes instituciones en zonas endémicas de la enfermedad de Hansen.
Palabras clave: Pruebas inmunológicas; enfermedad de Hansen; Diagnóstico; Lepra
Hansen's disease has a wide spectrum of clinical and histopathological manifestations, which are a reflection of the nature of the individual's immune response to various components of Mycobacterium leprae. The interaction between the host's immune system and different mycobacterial components allows us to know aspects of the differential immune response both serological and cellular response in patients with Hansen's disease. This paper involves summarizing the advances in the lasts 4 decades in Hansen's disease on diagnostic immunological testing (delayed hypersensitivity HR, in vitro cell proliferation and antibody tests) applied at both the Biomedicine Institute and updated trials conducted in other different institutions in areas endemic to Hansen's disease.
Key words: Immune tests; Hansen´s disease; Diagnostic; Leprosy
La lepra es una enfermedad infecciosa de baja transmisibilidad, no hereditaria. Hasta la primera década del siglo XXI y desde muchas décadas antes sólo se conocía el Mycobacterium leprae (M. leprae) como único causante de la enfermedad, pero desde el 2008 se ha implicado otra especie de micobacteria, el Mycobacterium lepromatosis (M. lepromatosis) como agente de un tipo de lepra grave, la lepra lepromatosa difusa o lepra de Lucio la cual se expresa clínicamente con grandes zonas de necrosis (Han et al., 2008; Han et al., 2015). El bacilo tiene preferencia por la piel y los nervios periféricos, pero puede afectar cualquier órgano menos el sistema nervioso central y los pulmones; sin embargo el M. lepromatosis está señalado de producir una enfermedad vascular causada por la invasión micobacterial de los vasos con vasculitis y oclusión vascular y con una alta morbilidad y mortalidad (Han et al., 2013). Ambos son bacilos intracelulares obligatorios y no son cultivables en ningún medio. La lepra es una enfermedad granulomatosa crónica y en el caso de la lepra producida por el M. leprae, sus formas clínicas se presentan en forma de espectro por la interacción del sistema inmunitario del huésped ante la invasión de la micobacteria.
La enfermedad de Hansen es una enfermedad de evolución lenta que se presenta con mayor frecuencia en la población adulta. Sin embargo en la infancia representa un problema de salud pública ya que refleja la transmisión activa de la enfermedad en la población y una exposición temprana al bacilo.
Una vez que el bacilo penetra al organismo, es fagocitado por los macrófagos y por las células dendríticas, produciéndose una primera fase donde actúa la inmunidad innata del individuo estableciéndose la infección, se produce una interacción entre la inmunidad del individuo y los mecanismos de evasión del M. leprae que trata de evadir los mecanismos de defensa del huésped.
Algunas veces las lesiones pasan desapercibidas y se confunden con otras patologías, entre ellas, enfermedades que cursan con máculas hipocrómicas: Pitiriasis alba, Pitiriasis versicolor, vitíligo, nevus acrónico o lesiones residuales tales como, hipocromía post inflamatorias y lesiones de psoriasis. También tenemos enfermedades con placas eritematosas: granuloma anular, Tinea corporis, esclerodermia, lupus eritematoso subagudo y sarcoidosis. Enfermedades que evolucionan con numerosas lesiones de tipo macular, placas y nódulos: leishmaniasis difusa, neurofibromatosis, sífilis, xantomatosis, linfomas, eritema multiforme y granulomatosis por sustancias inertes (Aranzazu, 1994).
La lepra se presenta en la edad adulta temprana con discapacidades por lo tanto su diagnóstico precoz, el adecuado manejo, el tratamiento específico de la misma, junto con el de la neuritis y los fenómenos reacciónales contribuirán a la disminución de las secuelas incapacitantes y a su erradicación definitiva. En la mayoría de los casos el diagnóstico clínico es tardío, ya que solo es posible realizarlo, una vez que se ha iniciado la sintomatología con la presencia de lesiones cutáneas y el daño de los nervios comprometidos.
En 1962 se desarrolló un sistema de clasificación basada en la correlación clínico, inmunológica e histopatológica. En el espectro de la enfermedad se encuentran las siguientes formas: Tuberculoide (LT), Bordeline Tuberculoide (BT), Bordeline Bordelin e (BB), Bordeline Lepromatosa (BL) y Lepromatosa (LL). Desde la introducción de la poliquimioterapia (PQT), la organización mundial de la salud (OMS) establece una clasificación en Paucibacilar (PB) y Multibacilar (MB) basándose en la carga bacilar del paciente y posteriormente se tomó en cuenta el número de lesiones y los nervios involucrados, siendo muy útil para la asignación de grupos de tratamiento (Ridley et al., 1966; WHO, 2000).
El tratamiento de la lepra tanto para adultos como niños usando poliquimioterapia (PQT) está formado por tres drogas antimicobacterianas: dapsona, rifampicina y clofazimina; 6 meses para pacientes PB y 12 meses para las formas clínicas MB, siempre tomando en cuenta que existen empaques ajustados por la OMS para niños de 10 a 14 años y para los menores de 10 años, la dosis debe ser ajustada al peso corporal (WHO, 2018).
El diagnóstico temprano es uno de los mayores obstáculos en el control de la enfermedad. En el estudio inmunológico se evalúa la respuesta celular tanto in vivo como in vitro y la respuesta humoral. Mucho antes del conocimiento del genoma del Mycobacterium leprae y de pruebas serológicas muy específicas para el diagnóstico de la enfermedad, se contaba con dos tipos de antígenos para medir la respuesta celular in vivo: El Mitsuda y el antígeno proteico completo de M. leprae. El Mitsuda o lepromina-H es un antígeno particulado del cuerpo bacilar, la cual está en desuso porque su preparación es a partir de material de armadillo infectado y en la actualidad no se cuenta en ninguna parte del mundo con colonias de armadillos para la obtención del mismo. La reacción positiva de Mitsuda tuvo un valor pronóstico y permitió clasificar y pronosticar el estado de resistencia ante la enfermedad (Krotoski et al., 1993). El antígeno soluble proteico de M. leprae (antígeno Convit) preparado y utilizado durante varias décadas en el Instituto de Biomedicina, se utilizó en diferentes pruebas entre ellas están, las pruebas cutáneas de hipersensibilidad retardada (HR) y en estudios in vitrotanto en la respuesta inmunológica mediada por células como en los estudios in vitro en la respuesta de anticuerpos. Para la obtención del antígeno proteico completo de M. leprae, inicialmente se procedió a la purificación del bacilo siguiendo el protocolo de Draper (Draper, 1979), proveniente del tejido de armadillo infectados experimentalmente. La obtención del extracto proteico de M. leprae utilizado para las pruebas de HR se procesó en el laboratorio de Inmunología II bajo la dirección de la Dra. Marian Ulrich+, coordinadora del laboratorio, donde una fracción proteica del sobrenadante se obtuvo mediante la ruptura parcial de los bacilos purificados utilizando una celda de presión (prensa francesa), bajo una presión de 10.000 libras. El extracto obtenido de esta manera fue subfraccionado al pasarlo a través de un sistema de ultrafiltración Amicon, luego se utilizó una membrana PM-30 que retiene moléculas por encima de 30.000 daltons y la fracción obtenida fue un antígeno de bajo peso molecular (Ulrich et al., 1986). El antígeno soluble fue una prueba usada en su momento para medir infección y se comportó como un antígeno de tipo tuberculínico donde la lectura se realiza a las 48 horas y se considera positiva una induración ≥ de 12 mm (Pinardi et al., 1994), la cual tuvo problemas de especificidad al presentar sensibilidad cruzada con el PPD (Gupte et al., 1990). En base a los estudios preliminares utilizando el antígeno Convit y el antígeno Rees, se han concentrado los esfuerzos en preparar nuevos antígenos para pruebas cutáneas en la enfermedad de Hansen (Brennan, 2000). Estos antígenos de segunda generación son: MLSA-LAM, antígeno soluble desprovisto de lipoglicanos principalmente la molécula lipoarabinomanosa y el MLC-WA antígeno proteico de pared celular los cuales han sido ensayados en conejillos de india encontrándose una fracción proteica de la membrana del M. leprae prometedora para estudios en las pruebas intradérmicas. Recientemente estudios realizados con estos antígenos anteriormente señalados se probaron en regiones no endémicas de Hansen (USA) (Brennan, 2000). En los primeros ensayos ejecutados en fase I, los individuos recibieron tres dosis (2,5μg, 1μg y 0,1μg) de cada uno de los antígenos paralelamente con el antígeno Rees MLSA luego se realizó un ensayos doble ciego (fase II) en zona endémica (Nepal) donde colocaron una dosis alta y una baja dosis (1μg y 0,1μg) dividieron la población (BL/LL, BT/TT,TB) y no casos; donde resultó que estos antígenos fueron seguros para el uso en humanos pero la sensibilidad obtenida fue baja (20-25%) y concluyen que estos antígenos no son adecuados para ser utilizados en pruebas de piel para la detección temprana de la enfermedad. Sin embargo, el grado de especificidad fue bastante alto por no presentar reacción cruzada con individuos que presentaron tuberculosis (TB) (Rivoire et al., 2014a; Rivoire et al., 2014b).
Continuando los progresos, para obtener una verdadera incidencia de la enfermedad y su impacto sobre la transmisión, es imperativo obtener una combinación de antígenos múltiples, sensibles y específicos para detectar una infección temprana con M. leprae. Actualmente, en vista de la alta prevalencia de casos de lepra en áreas endémicas como India, Brasil, Bangladesh y Filipinas, se realizó una prueba de hipersensibilidad retardada en modelos animales (conejillos de india y armadillos). La proteína de M. leprae sensible y especifica que se utilizó en el estudio, es la proteína quimérica (LID-1) la cual es capaz de distinguir entre animales infectados y no infectados presentando manifestaciones de HR similares a las presentes en pacientes PB (Duthie et al., 2020).
Durante la década del 1980, se realizaron en el Instituto de Biomedicina ensayos de proliferación celular de linfocitos en sangre venosa periférica en pacientes LL, BL, LT y personas sanas contactos. Estos ensayos se basaron en la respuesta de los linfocitos frente antígenos como: el bacilo Calmette-Guerin (BCG) muerto por calor, M. leprae purificado y extracto soluble de M. leprae, donde se encontró que el tratamiento combinado utilizado por Convit y colaboradores, PQT mas inmunoterapia (IMT), mostró una respuesta inmune persistente frente al extracto proteico soluble de M. leprae y BCG (Rada et al., 1987; Rada et al., 1994; Rada et al., 1997b). La IMT consistió en utilizar dos microorganismos; el M. leprae muerto por el calor y la bacteria BCG atenuada, cuyo tratamiento se utilizó conjuntamente con PQT en pacientes con Lepra Indeterminada LI, BL y LL, llevando a conversión la reactividad intradérmica, degradación de los bacilos en la piel y marcada mejoría clínica. Continuando los estudios y con los buenos resultados obtenidos con el extracto proteico de M. leprae en los ensayos de proliferación celular, se seleccionaron varias fracciones proteicas con diferentes movilidades relativas de peso molecular (kDa). Para el fraccionamiento se realizó la técnica bioquímica electroforesis en poliacrilamida-SDS donde se observó una respuesta celular incrementada en cuatro fracciones proteicas, cuyos rangos fueron entre 66-65, 45-29, 22-18 y 14 kDa. Los primeros respondedores fueron los Contactos Mitsuda positivos, seguido de los pacientes tuberculoide, luego pacientes lepromatosos tratados con PQT mas IMT (Rada et al., 1991).
Siguiendo la búsqueda de proteínas más específicas para seguir los estudios de reactividad celular in vitro se solicitó al banco de proteínas recombinantes (OMS), una serie de proteínas micobacterianas tanto de M. tuberculosis, . bovis y M. leprae de diferentes peso moleculares, M. tuberculosis 70kDa, M. bovis 65 kDa, M. leprae 36, 28, 18 y 10 kDa, donde algunas proteínas ensayadas son proteínas de choque térmico y presentaron reactividad cruzada con sus homólogas en humanos sanos. Se pudo evidenciar que en la proteína completa de M. leprae deben haber otros componentes homólogos al extracto proteico de BCG que sean capaces de estimular la respuesta celular en los pacientes (Rada et al., 1997b).
En el año 2001, a raíz de la disponibilidad de la secuencia completa del genoma del bacilo de la lepra se han obtenido secuencias genéticas que codifican a diferentes proteínas de M. leprae (Vissa et al., 2001). Han sido muchos los progresos en la investigación post genómica, con la finalidad de encontrar los antígenos proteicos que puedan ser útiles en obtener una buena respuesta celular protectora. Durante las últimas dos décadas se han examinado alrededor de 200 proteínas bien definidas y caracterizadas con diferentes movilidades relativas utilizadas en diferentes ensayos inmunologicos (Geluk et al., 2011). Recientemente, los ensayos celulares continúan utilizando biomarcadores para detección de inmunidad innata y adaptativa como de inmunidad humoral en diferentes regiones endémicas del planeta (Asia, África, Sur América). Estos estudios han señalado su importancia en la detección de individuos con baja carga bacilar contribuyendo a la detección temprana de la enfermedad (Van Hooij et al., 2016; Van Hooij et al., 2018; Van Hooij et al., 2019).
Actividad serológica (estudios in vitro en la inmunidad humoral)
Sabemos que dependiendo del espectro clínico de la enfermedad, los pacientes de lepra pueden caracterizarse por tener una reactividad elevada de anticuerpos en pacientes multibacilares (LL/BL/BB) conjuntamente con una respuesta celular disminuida dirigida a antígenos del M. leprae, con un comportamiento inverso en los pacientes Paucibacilares (LI/LT/BT).
El glicolipido fenólico-I (GLP-I) fue descubierto en 1981, reportan que es un antígeno inmunodominante de la cubierta del Mycobacterium leprae (Hunter et al., 1981). La detección de anticuerpos circulantes IgM anti GLP-I, a través de la metodología ELISA (ensayo inmunoenzimatico) ha sido ampliamente usada como método diagnóstico en diferentes parte del mundo, sin embargo se ve limitado su valor diagnóstico en pacientes PB, ya que estos tienen índice bacteriano bajo o indetectable y estos últimos se caracterizan por su buena respuesta celular, en lugar de la respuesta humoral. En el Instituto de Biomedicina varios estudios se han realizados referentes a la respuesta de anticuerpos utilizando el GLP-I.
Durante aproximadamente dos décadas se utilizó el GLP-I nativo como método diagnóstico inmunológico para identificar a los pacientes que presentaban diferentes carga bacilar. Para el año 1991 se aplicó esta prueba a 29.113 contactos de pacientes lepromatosos en zonas endémicas de Venezuela (Táchira, Mérida y Apure) que fueron vacunados con la inmunoterapia, desarrollada por el Dr. Convit donde se evidenciaron 28 contactos con pruebas positivas frente al GLP-I. La mayoría de las lesiones encontradas fueron incipientes y que luego desaparecieron espontáneamente (Ulrich et al., 1991; Convit et al., 1992; Convit et al., 1993).
Mientras que las pruebas para la detección de anticuerpos IgM hacia el GLP-I se utilizan para ciertas aplicaciones, el uso de esta prueba no es adecuada para estudios epidemiológicos debido al registro de una proporción significativa de individuos sanos que pueden presentar positividad frente al GLP-I.
En el sentido de lograr una prueba más específica, sencilla y con capacidad de realizar detecciones tempranas de la enfermedad, se amplía el estudio en la utilización del GLP-I, evidenciándose en su estructura química la presencia de un segmento disacárido externo, lográndose la síntesis de esta neoglicoproteína, la cual se somete a múltiples variaciones químicas, hasta hacerla capaz de unirse a la albumina bovina, dando lugar a lo que se conoce hoy en día como natural di o trisacárido octyl ligado a albúmina de suero bovino (ND-o-BSA ó NT-O-BSA) (Brennan et al., 1994).
Es importante señalar que el conocimiento y secuenciación del genoma micobacteriano, ha dado nuevas directrices para la búsqueda y síntesis de marcadores proteícos que permitan desarrollar nuevas alternativas para realizar un diagnóstico temprano de la enfermedad (Vissa et al., 2001).
Se basan en conseguir una prueba de laboratorio que sea capaz de diagnosticar la enfermedad en personas asintomáticas o predecir la progresión de la enfermedad en áreas endémicas (Stefani, 2008; Lobato et al., 2011), así como también en conseguir antígenos para ensayos serológicos altamente específicos que conjuntamente con el GLP-I permitan mejorar la sensibilidad en el diagnóstico (Reece et al., 2006; Spencer et al., 2012).
Duthie y colaboradores demostraron que las proteínas micobacterianas (ML0405 y ML2331) son antígenos del M. leprae con un potencial diagnóstico en los pacientes con lepra multibacilar independiente de la ubicación geográfica y/o zonas endémicas Además plantearon la construcción de una proteína de fusión entre las proteínas ML0405 y la ML2331 llamada LID-1 la cual puede proporcionar una herramienta de diagnóstico antes de la aparición de signos y síntomas clínicos (Duthie et al., 2008). Por lo tanto, a pesar de que M. leprae posee niveles de homología con otras especies de micobacterias, estas proteínas sólo se reconocen en el contexto de la lepra. Las mencionadas proteínas, se probaron en individuos contactos, de zonas endémicas en Venezuela que habían sido vacunados previamente con BCG y no desarrollaron respuesta serológica frente a LID-1 (Duthie et al., 2011; Rada et al., 2012). Actualmente, se han utilizado el GLP-I sintético (ND-o-BSA) antigénicamente activo o inmunodominante unido con la proteína de fusión LID-1 en diferentes regiones (ND-o-LID-1). Estudios realizados en Venezuela determinaron la respuesta de anticuerpos dirigida hacia el conjugado ND-o-LID-1 y sus componentes individuales LID-1 y ND-o- HSA en individuos del Caserío Mamaría ubicado en el Estado Portuguesa. Se incluyeron 167 individuos, clasificados en casos y contactos. Clínicamente se confirmaron 37,1% casos (62/167), de los cuales 71% (44/62) eran Paucibacilares y 29% (18/62) Multibacilares. Al comparar la respuesta de anticuerpos entre los casos de Hansen y contactos, se observó una diferencia estadísticamente significativa (16,13% versus 5,7%, respectivamente, p=0,013). Al determinarse la filiación familiar de los individuos incluidos en el estudio, se detectaron tres familias de interés: C, T y H. Los casos de Lepra presentes en las tres familias representan el 42% de los casos totales, registrándose en la familia C todas las formas clínicas de esta enfermedad. Los resultados obtenidos en dicho caserío sugieren que los marcadores empleados en este trabajo son de gran utilidad para ser empleados como herramienta auxiliar para el diagnóstico de la enfermedad de Hansen en los casos multibacilares (Rada et al., 2019).
Este conjugado (ND-o-BSA) ha sido probado también en diferentes regiones Brasil, Cebú Filipinas, China tanto en pacientes MB y PB, contactos de zonas endémica de la región, pacientes con tuberculosis y personas sanas demostrando una mayor sensibilidad y especificidad comparada con el GLP-I nativo y con el sintético, ND-o-BSA (Qiong-Hua et al., 2013). Aunque la utilización de una prueba rápida (RDT) no ha sido lo suficientemente sensible para la detección de casos con baja carga bacilar, por lo que se han hecho modificaciones añadiendo al conjugado la proteína A para aumentar la sensibilidad (Jian et al., 2020; Vaz Cardoso et al., 2013; Muñoz et al., 2018).
Gracias a los estudios realizados con técnicas moleculares como la reacción en cadena de polimerasa (PCR), utilizando fracciones específicas de ADN de M. leprae, método de cierta rigurosidad, se logra un diagnóstico seguro, principalmente cuando hay pocos bacilos. La utilización del conjugado ND-o-LID-1, con biomarcadores proteicos específicos para M. leprae y métodos complementarios con PCR permiten conocer respuestas tanto de inmunidad innata como de inmunidad adquirida. Datos obtenidos en regiones endémicas para el monitoreo de contactos y haciendo uso de modelos matemáticos, los resultados han permitido diagnosticar casos de lepra con una alta sensibilidad y especificidad y a su vez la identificación temprana de nuevos casos entre los contactos domésticos (Gama et al., 2019).
La finalidad de la estrategia mundial que se plantea para la eliminación de la lepra 2016-2020 tiene como objeto acelerar la acción hacia un mundo sin la enfermedad. Su fundamento se basa en la detección temprana de los casos utilizando biomarcadores tanto de la inmunidad innata como adquirida y de esta manera aplicar los programas de salud, antes de la aparición de las discapacidades presentes en esta enfermedad.